?土壤 抗生素類(lèi)化合物的測定 超聲提取-固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（征求意見(jiàn)稿）

1 范圍

      本文件規定了土壤中17種抗生素類(lèi)化合物的超聲提取-固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。   

      本文件適用于土壤中磺胺氯噠嗪、磺胺甲基嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺吡啶、克拉霉素、脫水紅霉素、北里霉素、羅紅霉素、泰樂(lè )菌素、金霉素、土霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、甲氧芐氨嘧啶和林可霉素17種抗生素（見(jiàn)附錄A）的定性和定量檢測。

      當土壤干重為2.0 g，經(jīng)提取、凈化和濃縮全過(guò)程處理后，定容體積為1.0 ml，進(jìn)樣體積為10μl時(shí)，17種抗生素的方法檢出限為0.9g/kg～4.7g/kg，測定下限為3.6μg/kg～19μg/kg。詳見(jiàn)附錄B。

2 規范性引用文件

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      HJ 613 土壤 干物質(zhì)含量和水分的測定 重量法

      HJ/T 166 土壤環(huán)境監測技術(shù)規范

3 術(shù)語(yǔ)與定義

      本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4 方法和原理

      過(guò)篩土壤以乙腈-McIlvaine緩沖液為提取劑，采用超聲波輔助提取目標抗生素。提取液經(jīng)固相萃取柱富集、凈化、定容后，采用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜檢測。根據目標物的保留時(shí)間、特征離子對及其豐度定性，采用內標法定量。

5 干擾和消除

      四環(huán)素類(lèi)抗生素可與土壤中的金屬離子結合形成絡(luò )合物，干擾提取過(guò)程，降低此類(lèi)化合物的提取效率。在提取過(guò)程中，加入金屬離子螯合劑乙二胺四乙酸四鈉，可抑制金屬離子的干擾。

6 試劑和材料

6.1 實(shí)驗用水為新制備不含目標化合物的純水。

6.2 硫酸：ρ (H₂SO₄) = 1.84 g/ml，分析純。

6.3 氫氧化鈉（NaOH）：分析純。

6.4 甲醇（CH₃OH）：色譜純。

6.5 乙腈（CH₃CN）：色譜純。

6.6 甲酸（HCOOH）：色譜純。

6.7 乙酸銨（CH₃COONH₄）：色譜純。

6.8 磷酸氫二鈉十二水化合物（Na₂HPO₄·12H₂O）：分析純。

6.9 檸檬酸一水化合物（C₆H₈O₇·H₂O）：分析純。

6.10 乙二胺四乙酸四鈉（Na₄EDTA）：分析純。

6.11 硫酸溶液：c (H₂SO₄)= 4.0 mol/L。量取 22 ml 硫酸（6.2），緩慢加入到純水中，待溫度降至室溫后，用純水定容到 100 ml。室溫下保存期為 3 個(gè)月。

6.12 NaOH 溶液（1.0 mol/L）：稱(chēng)取 4 g 氫氧化鈉（6.3）溶于純水中，定容至 100 ml。室溫下保存期為 2 個(gè)月。

6.13 氫氧化鈉的甲醇溶液：量取 1.0 ml 1.0 mol/L 的氫氧化鈉溶液（6.12）溶于甲醇（6.4）中，定容至 200 ml。臨用現配。

6.14 甲酸-乙酸銨的水溶液：量取 1.5 ml 甲酸（5.5）并稱(chēng)取 0.116 g 乙酸銨（6.7），溶于 750 ml 純水中，制備成 0.2%（V/V）甲酸-2.0 mmol/L 乙酸銨的水溶液。臨用現配。

6.15 甲酸-乙酸銨-乙腈的混合液：分別量取 90 ml 甲酸-乙酸銨的水溶液（6.14）和 10 ml 乙腈（6.5）， 混合并搖勻。臨用現配。

6.16 磷酸氫二鈉溶液（0.2 mol/L）：稱(chēng)取 71.628 g 磷酸氫二鈉十二水化合物（6.8）溶于純水中，定容至 1000 ml。室溫下保存期為 3 個(gè)月。

6.17 檸檬酸溶液（0.1 mol/L）：稱(chēng)取 21.014 g 檸檬酸一水化合物（6.9）溶于純水中，定容至 1000 ml。室溫下保存期為 3 個(gè)月。

6.18 McIlvaine 緩沖液（pH = 4）：分別量取 380 ml 磷酸氫二鈉溶液（6.16）和 620 ml 檸檬酸溶液（6.17），混合并搖勻。室溫下保存期為 3 個(gè)月。

6.19 乙腈-McIlvaine 緩沖液的混合液（1: 1，V/V）：分別量取 10 ml 乙腈（6.5）和 90 ml McIlvaine緩沖液（6.18），混合并搖勻。臨用現配。

6.20 石英砂：粒徑 150 ～ 250μm（100 ～ 60 目）。使用前置于馬弗爐中 450℃烘烤 4 h，冷卻后裝入磨口玻璃瓶中密封，于干燥器中保存。

6.21 抗生素標準儲備液：ρ＝100 mg/L（參考濃度）

      17種抗生素單標可直接購買(mǎi)市售有證標準溶液，也可用標準物質(zhì)（純度≥ 98%）制備。

      使用標準物質(zhì)制備標準儲備液的參考方法：準確稱(chēng)取10.0 mg抗生素標準物質(zhì)，溶于100 ml甲醇（6.4） 中，最終濃度為100 mg/L；對于喹諾酮類(lèi)抗生素，則溶于100 ml氫氧化鈉的甲醇溶液（6.13）中。儲備液應在-18 °C以下避光保存3個(gè)月或參照制造商的產(chǎn)品說(shuō)明。使用時(shí)應恢復至室溫，并搖勻。

6.22 抗生素標準使用液：ρ＝1.0 mg/L（參考濃度）

      將17種抗生素標準儲備液（6.21）按需要用甲醇（6.4）稀釋。標準使用液在?18℃以下避光保存3個(gè)月。使用時(shí)應恢復至室溫，并搖勻。

6.23 內標物儲備液：ρ＝100 mg/L（參考濃度）

      8種抗生素內標物為環(huán)丙沙星-d₈、脫水紅霉素-13C-d₃、林可霉素-d₃、磺胺甲嘧啶-d₄、磺胺二甲嘧啶-13C₆、磺胺甲噁唑-d₄、噻苯咪唑-d₄、甲氧芐氨嘧啶-d₃?？芍苯淤徺I(mǎi)市售有證標準溶液，也可用標準物質(zhì)（純度≥ 95%）制備。儲備液應在–18 °C以下避光保存3個(gè)月或參照制造商的產(chǎn)品說(shuō)明。使用時(shí)應恢復至室溫，并搖勻。每種抗生素對應的內標物詳見(jiàn)附錄A。其它符合內標物性質(zhì)的化合物也能夠使用。

6.24 內標物使用液：ρ＝1.0 mg/L（參考濃度）

      取8種內標物儲備液（6.23）按需要用甲醇（6.4）稀釋。內標物使用液在?18 ℃以下避光保存3個(gè)月。使用時(shí)應恢復至室溫，并搖勻。

6.25 離子交換柱：填料為高純硅膠基質(zhì)上鍵合三甲基氨丙基的強陰離子交換吸附劑(SAX)或其他等效   離子交換柱，參考規格為 500 mg/6 ml。

6.26 固相萃取柱：填料為二乙烯苯和 N-乙烯基吡咯烷酮共聚物（HLB）或其他等效固相萃取柱，參考規格為 200 mg/6 ml。

6.27 氮氣：純度≥ 99.99%。

6.28 濾膜：0.22 μm 尼龍濾膜。

7 儀器和設備

7.1 棕色玻璃瓶：具塞磨口，250 ml。

7.2 冷凍干燥機。

7.3 球磨機：配瑪瑙球磨罐和不同尺寸的瑪瑙球。

7.4 超聲波裝置：水槽式，超聲波輸出功率不小于 500 W，超聲時(shí)間可調節。

7.5 離心機：4000 r/min 或以上。

7.6 固相萃取裝置：流速可調節。

7.7 濃縮裝置：氮吹濃縮儀或性能相當的設備。

7.8 高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）。

7.9 色譜柱：C₁₈ 或等效反相高效液相色譜柱，參考規格為 100 mm（長(cháng)度）× 2.1 mm (內徑)，1.8 μm (填料粒徑)。

7.10 一般實(shí)驗室常用儀器和設備。

8 樣品

8.1 樣品的采集與保存

      按照HJ/T 166的相關(guān)規定進(jìn)行土壤樣品的采集和保存。

      樣品應保存在潔凈的棕色玻璃瓶（7.1）中，運輸過(guò)程中應避光冷藏。運回實(shí)驗室后，在0～4 ℃避光保存，并于一周內完成樣品前處理。

8.2 試樣制備

8.2.1 樣品預處理

      將新鮮土壤置于不銹鋼或聚四氟乙烯盤(pán)中，除去樹(shù)枝、葉子和石子等異物，混勻。取適量的混勻土   樣，放入冷凍干燥機（7.2）中脫水。凍干后的樣品用球磨機（7.3）或瑪瑙研缽研磨充分后，過(guò)60目（孔   徑0.25 mm）標準土壤篩，待提取。

8.2.2 提取

      稱(chēng)取2 g（精確到0.01 g）預處理后的土樣（8.2.1）于50 ml聚丙烯離心管中，加入100l內標物使用液（6.24），混勻，于0～4 ℃避光保存12 h，待甲醇揮發(fā)。加入0.5 g乙二胺四乙酸四鈉（6.10）和20 ml 乙腈-McIlvaine緩沖液的混合液（6.19），渦旋震蕩20 s，再置于超聲波中15 min，4000 r/min室溫下離心10 min，收集上清液。

重復提取一次，合并兩次提取液，待后續處理。

8.2.3 凈化

      以1000 ml純水稀釋提取液（8.2.2），并用4 mol/L硫酸（6.11）調節pH值至3左右。

      將SAX陰離子交換柱（6.25）與HLB固相萃取柱（6.26）首尾串聯(lián)，固定在固相萃取裝置（7.6）上。依次用10 ml甲醇（6.4）和10 ml純水（6.1）活化萃取柱，保證柱頭浸潤。提取液以5～10 ml/min的流速通過(guò)小柱。待提取液全部通過(guò)小柱后，拆下SAX柱，用10 ml純水淋洗HLB柱，去除小柱上的乙二胺四乙酸四鈉（6.10）。真空抽濾使HLB柱干燥。用5 ml甲醇（6.4）以約0.5 ml/min的流速洗脫兩次，收集全部洗脫液。

      注：固相萃取凈化過(guò)程中宜用錫箔紙包裹固相萃取柱避光。

8.2.4 濃縮定容

      洗脫液（8.2.3）采用氮氣（6.27）在40 °C下緩慢吹至近干，用甲酸-乙酸銨-乙腈的混合液（6.15） 定容至1.0 ml，尼龍濾膜（6.28）過(guò)濾后，待測。

8.3 空白試樣

      以石英砂（6.20）代替實(shí)際樣品，按照與試樣制備（8.2）相同操作步驟，制備空白試樣。

8.4 干物質(zhì)含量測定

      另稱(chēng)取一份冷凍干燥后的樣品進(jìn)行干物質(zhì)含量的測定，具體要求按照HJ 613執行。

9 分析步驟

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