《土壤 抗生素類(lèi)化合物的測定 超聲提取-固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（征求意見(jiàn)稿）》 編制說(shuō)明

1. 項目背景

1.1 任務(wù)來(lái)源

      近年來(lái)，土壤環(huán)境中抗生素的污染問(wèn)題受到研究人員、政府部門(mén)和大眾的廣泛關(guān)注。廣東省政府對土壤中抗生素的污染非常重視，為配合貫徹《廣東省土壤污染防治行動(dòng)計劃實(shí)施方案》，規范土壤環(huán)境中抗生素的檢測方法，特制定本標準。

      根據《廣東省市場(chǎng)監督管理局關(guān)于批準下達省地方標準制修訂計劃項目的通告》(2019 年第 7 號)，廣東省環(huán)境監測中心、華南師范大學(xué)環(huán)境研究院負責起草《土壤 抗生素類(lèi)化合物的測定 超聲提取-固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》。

1.2 工作過(guò)程

1.2.1 成立標準編制工作小組

      根據 2019 年 1 月 7 日發(fā)布的《廣東省市場(chǎng)監督管理局關(guān)于批準下達省地方標準制修訂計劃項目的通告》(2019 年第 7 號)，廣東省環(huán)境監測中心和華南師范大學(xué)環(huán)境研究院接到制定《土壤 抗生素類(lèi)化合物的測定  超聲提取-固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》的任務(wù)后，成立標準編制工作小組，由從事多年抗生素研究經(jīng)驗、熟悉樣品前處理、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的技術(shù)人員承擔本工作。

1.2.2 查詢(xún)國內外相關(guān)標準和文獻資料

      2019 年 1 月，標準編制工作組根據有關(guān)標準制修訂工作管理辦法的相關(guān)規定， 檢索、查詢(xún)和收集國內外相關(guān)標準和文獻資料。調研發(fā)現，國內外抗生素的檢測方法有微生物法、酶聯(lián)免疫吸附法、氣相色譜法、毛細管電泳檢測技術(shù)法、液相色譜法、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等。微生物法和酶聯(lián)免疫吸附法等檢測技術(shù)存在費時(shí)、抗體制備不易、敏感性差、假陽(yáng)性率高等缺點(diǎn)；氣相色譜法和毛細管電泳檢測技術(shù)則受限于抗生素的非揮發(fā)或熱不穩定性以及不同環(huán)境中電荷性質(zhì)的差異性等而不適宜于抗生素的大量檢測。近來(lái)越來(lái)越多的文獻研究結果表明，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(以下簡(jiǎn)稱(chēng) LC-MS/MS)是一種高效、準確和靈敏的抗生素檢測方法。但是，目前國內暫無(wú)采用 LC-MS/MS 測定土壤環(huán)境中抗生素的相關(guān)標準。

1.2.3 確定標準制訂技術(shù)路線(xiàn)，制訂原則

      2019 年 1 月至 3 月，確定了本標準的具體內容、原則、技術(shù)路線(xiàn)等內容。根據我國抗生素的使用量、土壤中常見(jiàn)抗生素的檢出情況等資料，確定了我國常用的 17 種抗生素為目標物質(zhì)，包括 6 種磺胺類(lèi)、2 種氟喹諾酮類(lèi)、5 種大環(huán)內酯類(lèi)、2 種四環(huán)素類(lèi)、林可霉素和甲氧芐氨嘧啶，采用超聲輔助提取-固相萃取柱凈化-LC-MS/MS 法分析的技術(shù)方案，實(shí)現對不同性質(zhì)土壤中痕量抗生素的高效、準確測定。

1.2.4 實(shí)驗室內部方法開(kāi)發(fā)

      2019 年 4 月至 9 月，標準編制組采用超聲輔助提取-固相萃取柱凈化-LC-MS/MS 分析的方法，在華南師范大學(xué)環(huán)境研究院廣東省化學(xué)品污染與環(huán)境安全重點(diǎn)實(shí)驗室內部開(kāi)展了檢出限、精密度、準確度、方法適用性等系列的方法開(kāi)發(fā)工作。實(shí)驗結果表明，當土壤干重為 2.0 g，經(jīng)提取、凈化和濃縮后定容體積為 1.0 ml，進(jìn)樣體積

為 10μl 時(shí)，17 種抗生素的方法檢出限為 0.6μg/kg～ 4.7μg/kg，測定下限為 2.4μg/kg ～19 μg/kg?？蓪?shí)現土壤中痕量抗生素的定量分析。

1.2.5 編寫(xiě)標準文本和編制說(shuō)明初稿

      2019 年 10 月至 12 月，標準編制工作小組匯整前期研究成果，編寫(xiě)標準草案及編制說(shuō)明。

1.2.6 開(kāi)展方法驗證工作

      2020 年 5 月至 8 月，標準編制工作組確定了外部 6 家實(shí)驗室進(jìn)行方法驗證，于2020 年 9 月收回全部的驗證報告，在此基礎上進(jìn)行了數據的匯總和分析整理工作， 并編寫(xiě)完成了驗證匯總報告。

1.2.7 編寫(xiě)標準文本（征求意見(jiàn)稿）和編制說(shuō)明

      2020 年 9 月至 11 月，標準編制工作組編寫(xiě)《土壤 抗生素類(lèi)化合物的測定 超聲提取-固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（討論稿）》的標準文本及編制說(shuō)明， 并于 2020 年 11 月 3 日組織專(zhuān)家對標準文本（討論稿）及編制說(shuō)明進(jìn)行了初步論證。根據專(zhuān)家意見(jiàn)進(jìn)一步修改，形成標準文本（征求意見(jiàn)稿）及編制說(shuō)明。

2 標準制修訂的必要性

2.1 目標污染物的環(huán)境危害

2.1.1 目標污染物的基本性質(zhì)

      抗生素是由微生物(細菌、真菌和放線(xiàn)菌) 在生長(cháng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生或由人工合成或半合成的，能抑制微生物生長(cháng)的小分子化合物。由于抗生素在人類(lèi)臨床疾病治療和畜牧水產(chǎn)業(yè)中的廣泛應用，自 1929 年英國科學(xué)家弗萊明發(fā)現青霉素以來(lái)，隨著(zhù)科技的進(jìn)步，不斷有新的抗生素被發(fā)現或合成，抗生素隊伍得以不斷壯大，至今已達上萬(wàn)種，不僅包括微生物產(chǎn)生的，也包括高等動(dòng)植物產(chǎn)生的代謝物以及用化學(xué)方法合成和半合成的化合物；不僅包括抗細菌的物質(zhì)，也包括抗腫瘤、抗原蟲(chóng)、抗病毒、抗真菌、抗藻類(lèi)、抗寄生蟲(chóng)等的物質(zhì)。

      目前常見(jiàn)的抗生素類(lèi)型主要有：

      (1) 磺胺類(lèi)：磺胺類(lèi)藥物是應用最早的一類(lèi)人工合成抗菌藥物?；前奉?lèi)藥物屬于 廣譜抗菌藥物，因其抗菌譜廣、療效強、方便安全等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于人體和動(dòng)物(各 種畜禽、水產(chǎn)和寵物)  。常見(jiàn)的磺胺類(lèi)藥物主要有磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、復方新諾明(磺胺甲噁唑+甲氧芐氨嘧啶) 等?；前返姆肿又泻幸粋€(gè)苯環(huán)，一個(gè)對位氨基和一個(gè)磺酰胺基?；前奉?lèi)化學(xué)物主要是 通過(guò)各種化學(xué)基團來(lái)取代磺酰胺基上的氫原子制備的有效衍生物(圖 1)。

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??圖 1 主要的抗生素種?

類(lèi)(2) 四環(huán)素類(lèi)：四環(huán)素是一類(lèi)被廣泛使用的廣譜抗生素，能通過(guò)與核糖體 30S 亞基結合，阻止氨酰-tRNA 與核糖體結合而抑制細菌蛋白質(zhì)的合成。四環(huán)素類(lèi)抗生素可與 Ca2+、Mg2+、Fe2+和 Al3+等金屬離子形成絡(luò )合物，影響藥效。同時(shí)與 Ca2+形成的不溶絡(luò )合物會(huì )影響小兒的牙齒變黃和骨骼發(fā)育，因此小孩和孕婦禁用四環(huán)素類(lèi)抗生素。常見(jiàn)的四環(huán)素類(lèi)抗生素有金霉素、土霉素、強力霉素、甲烯土霉素、甘氨酰環(huán)素等。目前，四環(huán)素類(lèi)抗生素多用于養殖業(yè)，如養豬、養雞和水產(chǎn)養殖等。

      (3) 喹諾酮類(lèi)：喹諾酮類(lèi)藥物是一類(lèi) 4-氧-1,4-二氫喹諾酮為原始骨架的人工合成抗生素。喹諾酮類(lèi)藥物通過(guò)在 DNA 解鏈階段俘獲細菌型 IIA 拓撲異構酶、DNA 旋轉酶和拓撲異構酶 IV 而對染色體拓撲異構化產(chǎn)生干擾，阻滯 DNA 單鏈部分的復性，從而抑制細菌 DNA 的復制而發(fā)揮抑菌作用。自 20 世紀 60 年代萘啶酸、吡咯酸、惡喹酸等的發(fā)現開(kāi)始，喹諾酮藥物已發(fā)展至第四代，抗菌活性逐漸增強，副作用降低?，F已被廣泛用于人畜疾病治療，常用的主要為第三代喹諾酮類(lèi)，如環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾氟沙星和培氟沙星等。該類(lèi)物質(zhì)相對較穩定，水溶性偏低。

      (4)β-內酰胺類(lèi)：β-內酰胺類(lèi)是一類(lèi)含有β-內酰胺環(huán)的抗生素，其通過(guò)抑制革蘭氏陰性細菌細胞壁合成的最后一步而對細菌產(chǎn)生抑制作用。該類(lèi)抗生素具有殺菌活性強、藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)良好、低宿主毒性以及與其它種類(lèi)抗生素(例如氨基糖苷類(lèi)) 協(xié)同增效等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應運于臨床和畜牧業(yè)中。青霉素類(lèi)水溶液不穩定， 極易失效；不耐熱；酸、堿、重金屬及青霉素酶可使其β-內酰胺環(huán)破裂，導致失效。常用的有青霉素、苯唑西林、氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢噻肟等。

      (5)大環(huán)內酯類(lèi)：大環(huán)內酯類(lèi)抗生素是一類(lèi)具有大環(huán)內脂結構，可抑制大多數革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的廣譜一線(xiàn)抗生素。大環(huán)內酯類(lèi)通過(guò)與細菌核糖體 50S 亞基可逆性結合，抑制蛋白質(zhì)的合成，發(fā)揮抑菌活性。常見(jiàn)的大環(huán)內酯類(lèi)抗生素有紅霉素 A、阿奇霉素、泰樂(lè )菌素、竹桃霉素和北里霉素。

      (7)多肽類(lèi)：多肽類(lèi)抗生素是一類(lèi)具多肽結構特征的抗生素，通過(guò)作用于細菌的滲透壓屏障，損傷細胞質(zhì)膜而對細菌產(chǎn)生抑制，可分為多黏菌素類(lèi)、糖肽類(lèi)和桿菌肽類(lèi)。通常被用作抵抗革蘭氏陽(yáng)性菌的最后一道防線(xiàn)。常見(jiàn)的多肽類(lèi)抗生素有多黏菌素 B、桿菌肽、短桿菌肽、萬(wàn)古霉素、替考拉寧、奧利萬(wàn)星、達巴萬(wàn)星、特拉萬(wàn)星、氯依瑞霉素等。

      (8)林可酰胺類(lèi)：林可酰胺類(lèi)化學(xué)結構主要由氨基酸和寡糖構成，其主要作用機制為與核糖體 50S 亞基結合抑制肽鏈的生成，主要針對厭氧細菌和原生動(dòng)物感染。易引發(fā)惡心、嘔吐、腹瀉、皮疹、發(fā)燒等不良反應，很少用于臨床醫療，主要與大觀(guān)霉素聯(lián)合用于反芻動(dòng)物、豬和禽類(lèi)。該類(lèi)抗生素中的細菌自然代謝生成的代表有林可霉素和天青霉素，其半合成的代表有克林霉素和吡利霉素。

      (9)氯霉素類(lèi)：氯霉素是一種對多種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的廣譜抗生素， 氯霉素主要抑菌機理為通過(guò)與原核細胞中 50S 核糖體亞基結合，抑制蛋白質(zhì)的合成而阻止細菌繁殖。氯霉素分子主要由對硝基苯基、丙二醇與二氯乙酰胺三個(gè)部分組 成，性質(zhì)穩定。氯霉素類(lèi)能引發(fā)多種嚴重的副作用，例如骨髓抑制、再生性障礙貧血、血小板減少癥和粒細胞減少等，故中國、日本、加拿大、美國和澳大利亞等國 家現已明令禁止其使用。常見(jiàn)的氯霉素類(lèi)抗生素有氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考等。

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