警告：檢測人員應采取必要的生物安全防護措施（包括但不僅限于一次性手套、口罩、防護服、防護眼鏡、鞋套等防護用品）；檢測時(shí)應做好無(wú)菌防護，在無(wú)菌操作設備內進(jìn)行。
本標準規定了鑒定水中滅菌生物指示物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的生物學(xué)方法。
本標準適用于微生物實(shí)驗室滅菌效果的評價(jià)。
本標準引用了下列文件或其中的條款。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本標準。凡是未注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。
《消毒技術(shù)規范》（原衛生部衛法監發(fā)〔2002〕282 號）
下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標準。
3.1
枯草芽孢桿菌黑色變種 Bacillus subtilis var. niger
也稱(chēng)萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus），在含酪氨酸的培養基上形成黑色素的革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌。作為滅菌效果評價(jià)試驗的指示菌種。
3.2
滅菌 sterilization
物理或化學(xué)的方法殺滅全部微生物，包括致病和非致病微生物、芽孢和朊病毒蛋白，使之達到無(wú)菌保障水平。常用的滅菌方法有化學(xué)試劑滅菌（如環(huán)氧乙烷、甲醛等）、射線(xiàn)滅菌（如γ射線(xiàn)、電子束輻射等）、濕熱滅菌、干熱滅菌和過(guò)濾除菌等。
3.3
生物指示物 biological indicator
含有對特定滅菌過(guò)程具有一定耐受力的活微生物的生物制品。
注：生物指示物為特定滅菌過(guò)程是否滿(mǎn)足殺滅指定數量微生物的必須條件提供信息，并規定該過(guò)程的置信水平。
經(jīng)滅菌處置后含枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢的水樣通過(guò)孔徑為 0.45 μm 的濾膜過(guò)濾，細菌和芽孢被截留在濾膜上，然后將濾膜置于酪氨酸瓊脂培養基上，36 ℃±1 ℃培養 72 h～96 h，枯草芽孢桿菌黑色變種產(chǎn)生的酪氨酸酶可分解并利用酪氨酸形成黑色素，產(chǎn)生黑色的特征菌落。對特征菌落進(jìn)行染色鏡檢后通過(guò)生化試驗做進(jìn)一步鑒定，能利用甘油和甘露糖，可還原硝酸鹽和水解淀粉，不能利用苦杏仁苷和甘露醇，并確認為革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌的特征菌落為枯草芽孢桿菌黑色變種，鑒定結果為陽(yáng)性。
除非另有說(shuō)明，分析時(shí)均使用符合國家標準的分析純試劑，實(shí)驗用水為蒸餾水。
5.1 酪氨酸瓊脂培養基，見(jiàn)附錄 A.1。
5.2 營(yíng)養瓊脂培養基，見(jiàn)附錄A.2。
5.3 淀粉培養基和碘液，見(jiàn)附錄 A.3。
5.4 硝酸鹽還原培養基和相關(guān)試劑，見(jiàn)附錄A.4。
5.5 甘油復紅肉湯培養基，見(jiàn)附錄A.5。
5.6 甘露糖生化培養基，見(jiàn)附錄 A.6。
5.7 甘露醇生化培養基，見(jiàn)附錄 A.6。
5.8 苦杏仁苷生化培養基，見(jiàn)附錄A.7。
5.9 革蘭氏染色液，見(jiàn)附錄 A.8。
5.10 芽孢染色液，見(jiàn)附錄 A.9。
5.11 陰性對照菌：如地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。
5.12 陽(yáng)性對照菌：枯草芽孢桿菌黑色變種（Bacillus subtilis var. niger）。
5.13 枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液：按照《消毒技術(shù)規范》2.1.1.2.3（2）的規定制備，也可購買(mǎi)濃度范圍在 106 CFU/ml～109 CFU/ml 之間的市售枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液。
5.14 無(wú)菌濾膜：直徑 50 mm，孔徑 0.45 μm 的醋酸纖維濾膜。
按無(wú)菌操作要求包扎，經(jīng) 121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min，晾干備用；或將濾膜放入燒杯中，加入實(shí)驗用水，煮沸滅菌 3 次，15 min/次，前 2 次煮沸后需換水洗滌 2～3 次。也可采用市售的無(wú)菌濾膜。
5.15 石蠟質(zhì)封口膜。
5.16 無(wú)菌水：取適量實(shí)驗用水，經(jīng) 121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min，備用。
注 1：5.1～5.10 的成分及制備方法見(jiàn)附錄 A，也可使用市售商品化培養基或染色液；
注 2：5.11～5.12，建議購買(mǎi)由國內或國際菌種保藏機構保藏的遺傳學(xué)特性得到確認和保證并可追溯的標準菌株。
6.1 樣品瓶：螺口帶蓋或磨口具塞的 250 ml、500 ml 廣口玻璃瓶。
6.2 恒溫培養箱：36 ℃±1 ℃。
6.3 高壓蒸汽滅菌器：121 ℃，可調。
6.4 pH 計：準確到 0.1 pH 單位或更高精度。也可使用 pH 精密試紙。
6.5 顯微鏡：物鏡 4×或 5×、10×、20×、40×，油鏡 100×，目鏡 10×或 15×。
6.6 分析天平：實(shí)際分度值 0.0001g。
6.7 培養皿：直徑 90 mm。
6.8 過(guò)濾裝置：配有砂芯濾器、圓筒形玻璃漏斗和真空泵，抽濾壓力不低于-50 kPa。
6.9 接種環(huán)：直徑 1 mm～3 mm。
6.10 鑷子：不銹鋼或一次性無(wú)菌塑料鑷子。
6.11 刻度移液管：1 ml、10 ml。也可使用可調式移液器。
6.12 量筒：100 ml。
6.13 錐形瓶：100 ml。
6.14 酒精燈。
6.15 試管：10 ml。
6.16 無(wú)菌操作設備：無(wú)菌室、超凈工作臺、生物安全柜。
6.17 一般實(shí)驗室常用儀器和設備。
注：試驗前，移液管、樣品瓶、培養皿、錐形瓶、試管、砂芯濾器、圓筒形玻璃漏斗等玻璃器皿應按無(wú)菌操作要求包扎，高壓蒸汽滅菌器（6.3）中 121℃滅菌 20 min，烘干，備用。也可采用干熱滅菌（135℃～140 ℃滅菌 3 h～5 h，或 160℃～170℃滅菌 2 h～4 h，或 180℃～200℃滅菌 0.5h～1h）。
7.1 樣品采集
7.1.1 評價(jià)使用高溫高壓滅菌設備的滅菌效果時(shí)，取樣品瓶（6.1），加入枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液（5.13）及 200 ml 無(wú)菌水（5.16）使混合液中枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢終濃度達到 5×104 CFU/ml～ 5×105 CFU/ml。滅菌處置完畢后，取出樣品瓶，對水樣進(jìn)行滅菌生物指示物（枯草芽孢桿菌黑色變種） 的檢測。
7.1.2 評價(jià)使用其它滅菌設備的滅菌效果時(shí)，滅菌前取適量枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液（5.13）加入滅菌設備，使水樣中枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢終濃度達到 5×104 CFU/ml～5×105 CFU/ml。滅菌處置完畢后，從滅菌設備中采集水樣，進(jìn)行滅菌生物指示物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的檢測。采樣量一般為樣品瓶容量的 80%左右，不得用樣品洗滌樣品瓶。樣品采集完畢后，迅速用無(wú)菌包裝紙包扎樣品瓶。
7.2 樣品保存
樣品采集后宜在 2 h 內檢測，否則應在 10 ℃以下冷藏保存運輸，但不得超過(guò) 6 h。實(shí)驗室接收樣品后，不能立即開(kāi)展檢測的，樣品應在 4 ℃以下冷藏保存，并在 2 h 內檢測。
注：宜使用生物安全周轉箱進(jìn)行樣品周轉。
8.1 方法程序
樣品中枯草芽孢桿菌黑色變種的檢測程序見(jiàn)圖 1。
8.2 樣品過(guò)濾
用無(wú)菌鑷子（6.10）以無(wú)菌操作夾取無(wú)菌濾膜（5.14）貼放在已滅菌的過(guò)濾裝置（6.8）上，固定好過(guò)濾裝置。將樣品充分混勻后取 100 ml 抽濾，以無(wú)菌水（5.16）沖洗濾器內壁 2～3 次。
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下載地址:《HJ 1190-2021 水質(zhì) 滅菌生物指示物（枯草芽孢桿菌 黑色變種）的鑒定 生物學(xué)檢測法》
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