GB/T 24800.1-2009 化妝品中九種四環(huán)素類(lèi)抗生素的測定 高效液相色譜法

1 范圍

      本標準規定了化妝品中九種四環(huán)素類(lèi)抗生素的高效液相色譜測定方法。

      本標準適用干皮膚護理類(lèi)化妝品中九種四環(huán)素抗生素的測定。
      本標準二甲胺四環(huán)素的檢出限為25 mg/kg,土霉素、四環(huán)素、去甲基金霉素的檢出限為10 mg/kg, 金霉素、美他環(huán)素、多西環(huán)素的檢出限為5 mg/kg，差向脫水四環(huán)素和脫水四環(huán)素的檢出限為2.5 mg/kg。
      二甲胺四環(huán)素的定量限為50 mg/kg，土霉素、四環(huán)素、去甲基金霉素的定量限為25 mg/kg，金霉素、美他環(huán)素、多西環(huán)素的定量限為10 mg/kg，差向脫水四環(huán)素和脫水四環(huán)素的定雖限為5 mg/kg。

2 原理
      以甲醇為溶劑，超聲提取、離心，0.45 μm的有機濾膜過(guò)濾，溶液注入配有二極管陣列檢側器 (DAD)的液相色譜儀檢測，外標法定量。

3 試劑和材料

      除另有規定外試劑均為分析純

3.1 甲醇色譜純

3.2 乙腈色譜純

3.3 九種四環(huán)素純度不小于97.0％；土霉素，純度不小于97.9%；金霉素純度不小于99.0％；多西環(huán)素，純度不小于96.5%；美他環(huán)素，純度不小于99.6%．去甲基金霉素純度不小于99.0％；二甲胺四環(huán)素，純度不小于99.0%；脫水四環(huán)素純度不小于90.0％；差向脫水四環(huán)素，純度不小于90.0%。

3.4 九種四環(huán)素類(lèi)抗生素標準儲備液；準確稱(chēng)取各類(lèi)四環(huán)素(3.3)0.1g,精確到0000 1g,分別置于 50mL燒杯中加適量甲醇溶解溶液定里移入100 mL容量瓶中用甲醇稀釋至刻度，混勻即得濃度為1 000 mg/L的標準儲備液。
      九種四環(huán)素類(lèi)抗生素混合標準儲備液分別移取上述標準儲備液(3.4)各10 mL至100ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度即得濃度為100 mg/L的標準混合儲備液。

3.5 九種四環(huán)素類(lèi)抗生素標準工作溶液用甲醇將上述混合標準儲備液（3.5）分別配成一系列濃度為1m g/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L的標準工作溶液，冰箱冷藏保存，可使用一周。 

3.6 0.01 moI/L草酸溶液:稱(chēng)取草酸（C₂H₂O₄?2H₂O）1.26 g，精確至0.001 g,于50 mL燒杯中加水溶解后移入1 000mL容量瓶中用水定容至刻度，混勻，即得0.30 mol/L的草硅溶液。

4 儀器

4.1 液相色譜儀配有二極粉陣列檢側器。 

4.2 徽量進(jìn)樣器10μL。

4.3 超聲波清洗器

4.4 離心機，大于5 000 r/min。

4.5 溶劑過(guò)濾器和0.45 μm有機過(guò)濾膜。

5.1 樣品處理

      稱(chēng)取化妝品試樣約0.2g，精確到0. 001g，于10 mL具塞比色管中，加人約8 mL甲醇，在超聲波清洗器中超聲振蕩30min，冷卻至室溫后，加甲醇定容至刻度。取部分溶液放人離心管中，在離心機上于5000 r/min離心20min，離心后的上清液經(jīng)0.45μm有機濾膜過(guò)濾，濾液供測定用。

5.2 測定

5.2.1 色譜條件

5.2.1.1 色譜柱：Kromasil C₁₈柱（250 mm×4.6 mm（內徑）,5 μm，或相當者）。

5.2.1.2 流動(dòng)相：A：甲醇與乙睛的混合溶液(1+3,V/V) ,B:0. 01 mol/L的草酸溶液（3. 7)，梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

5.2.1.4 檢測波長(cháng)：程序可變波長(cháng)：0~4.00 min為350 nm,4.01 min-12.00 min為270 nm。

5.2.1.5 柱溫：25℃。

5.2.1.6 進(jìn)樣量：10μL,

5.2.2 標準工作曲線(xiàn)繪制

      分別移取一系列濃度為1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L的標準工作溶液，按色譜條件（5.2.1)進(jìn)行測定，記錄色譜峰面積，以色譜峰的峰面積為縱坐標，對應的溶液濃度為橫坐標作圖，繪制標準工作曲線(xiàn)。

      九種四環(huán)素的標準液相色譜圖參見(jiàn)附錄A的圖A.1。

5.2.3 試樣測定

      用微量注射器吸取試樣溶液（5. 1)注人液相色譜儀，按色譜條件（5. 2. 1)進(jìn)行測定，記錄色譜峰的保留時(shí)間和峰面積，由色譜峰的峰面積可從標準曲線(xiàn)上求出相應的濃度。樣品溶液中的被測物響應值均應在儀器測定的線(xiàn)性范圍之內。含量高的試樣可取適量試樣溶液用流動(dòng)相稀釋后進(jìn)行測定。

5.2.4 定性確認

      液相色譜儀對樣品進(jìn)行定性測定，進(jìn)行樣品測定時(shí)，如果檢出四環(huán)素類(lèi)抗生素的色譜峰的保留時(shí)間與標準品相一致，并且在扣除背景后的樣品色譜圖中，該物質(zhì)的紫外吸收圖譜與標準品的紫外吸收圖譜相一致，則可初步確認樣品中存在被測四環(huán)素類(lèi)抗生素。必要時(shí)，陽(yáng)性樣品需用其他方法進(jìn)行確認試驗。

5.3 平行試驗

      按以上步驟，對同一試樣進(jìn)行平行試驗測定。

5.4 空白試驗

      除不稱(chēng)取試樣外，均按上述步驟進(jìn)行。

6 結果計算

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