水質(zhì) 滅菌指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的鑒定 生物學(xué)檢測法（征求意見(jiàn)稿）

      警告：操作時(shí)應按要求佩戴防護器具，做好無(wú)菌防護；實(shí)驗室操作需在無(wú)菌操作設備內進(jìn)行，避免吸入呼吸道或接觸皮膚和衣物。

1 適用范圍

      本標準規定了鑒定水中滅菌指示微生物的生物學(xué)檢測方法。

      本標準適用于經(jīng)滅菌處置的廢水中指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的鑒定。

2 規范性引用文件

      本標準引用了下列文件或其中的條款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本適用于本標準。

      GB/T 6682 分析實(shí)驗室用水規格和實(shí)驗方法

      HJ 494 水質(zhì) 采樣技術(shù)指導

      HJ/T 91 地表水和污水監測技術(shù)規范

3 術(shù)語(yǔ)和定義

      下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標準。

3.1

      枯草芽孢桿菌黑色變種 Bacillus subtilis var. niger

      在含酪氨酸的培養基上形成黑色色素的革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，其營(yíng)養細胞呈桿狀，單個(gè)或呈短鏈狀排列，芽孢橢圓形，中生，不膨大，能利用甘油、甘露糖，還原硝酸鹽，水解淀粉，不能利用苦杏仁苷、甘露醇。

4 方法原理

      滅菌處置后的廢水通過(guò)孔徑為 0.45 μm 的濾膜過(guò)濾，細菌和芽孢被截留在濾膜上，然后將濾膜置于酪氨酸選擇性培養基上，37℃培養 72 h～96 h，枯草芽孢桿菌黑色變種產(chǎn)生的酪氨酸酶可分解利用酪氨酸形成黑色素，產(chǎn)生黑色的特征菌落。對特征菌落進(jìn)行染色鏡檢和生化試驗做進(jìn)一步鑒定，枯草芽孢桿菌黑色變種為革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，營(yíng)養細胞呈桿狀，單個(gè)或呈短鏈狀排列，芽孢橢圓形，中生，不膨大，能利用甘油、甘露糖，還原硝酸鹽，水解淀粉，不能利用苦杏仁苷、甘露醇。根據結果報告檢出或未檢出枯草芽孢桿菌黑色變種。

5 干擾和消除

5.1 活性氯具有氧化性，能破壞微生物細胞內的酶活性，導致細胞死亡，可在樣品采集（8.1） 時(shí)加入硫代硫酸鈉溶液（6.13）消除干擾。

5.2 重金屬離子具有細胞毒性，能破壞微生物細胞內的酶活性，導致細胞死亡，可在樣品采集（8.1）時(shí)加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.14）消除干擾。

6 試劑和材料

      除非另有說(shuō)明，分析時(shí)均使用符合國家標準的分析純試劑，實(shí)驗用水應滿(mǎn)足 GB/T 6682中三級水的要求。

6.1 酪氨酸瓊脂培養基。

6.2 營(yíng)養瓊脂培養基。

6.3 淀粉培養基。

6.4 硝酸鹽培養基。

6.5 甘油復紅肉湯培養基。

6.6 甘露糖生化培養基。

6.7 甘露醇生化培養基。

6.8 苦杏仁苷生化培養基。

6.9 革蘭氏染色液。

6.10 芽孢染色液。

注：6.1～6.10 的成分及制法詳見(jiàn)附錄 A，其中 6.2～6.10 也可使用市售商品化培養基或試劑。

6.11 硫代硫酸鈉（Na₂S₂O₃·5H₂O）。

6.12 乙二胺四乙酸二鈉（C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂·2H₂O）。

6.13 硫代硫酸鈉溶液：ρ(Na₂S₂O₃)=0.10g/ml。

稱(chēng)取 15.7g 硫代硫酸鈉（6.11），溶于適量水中，定容至 100 ml，臨用現配。

6.14 乙二胺四乙酸二鈉溶液：ρ(C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂·2H₂O)=0.15 g/ml。

      稱(chēng)取 15 g 乙二胺四乙酸二鈉（6.12），溶于適量水中，定容至 100 ml，此溶液保質(zhì)期為 30 d。

6.15無(wú)菌濾膜：直徑 50mm，孔徑 0.45 μm 的醋酸纖維濾膜。

      按無(wú)菌操作要求包扎，經(jīng) 121℃高壓蒸汽滅菌 20min，晾干備用；或將濾膜放入燒杯中，加入實(shí)驗用水，煮沸滅菌 3 次，15 min/次，前 2 次煮沸后需更換水洗滌 2～3 次。

6.16 石蠟質(zhì)封口膜。

6.17 無(wú)菌水：取適量實(shí)驗用水，經(jīng) 121℃高壓蒸汽滅菌 20 min，備用。

7 儀器和設備

7.1 采樣瓶：具螺旋帽或磨口塞的 500 ml 廣口玻璃瓶。

7.2 恒溫培養箱：允許溫度偏差 36℃±1℃。

7.3 高壓蒸汽滅菌器：121℃可調。

7.4 pH 計：準確到 0.1pH 單位，或更高精度。也可使用 pH 比色管或pH 精密試紙。

7.5 顯微鏡：物鏡 10×倍、20×倍、40×倍，油鏡 100×倍，目鏡 10×倍或 15×倍。

7.6 分析天平：感量 0.0001 g。

7.7 培養皿：直徑 90 mm。

7.8 過(guò)濾裝置：配有砂芯濾器和真空泵，抽濾壓力勿超過(guò)-50kPa。

7.9 接種環(huán)。

7.10 鑷子。

7.11 移液管：1 ml±0.01 ml、10 ml±0.1 ml。也可使用計量合格的可調式移液器。

7.12 量筒：100 ml。

7.13 三角瓶：100 ml。

7.14 酒精燈。

7.15 無(wú)菌操作設備：無(wú)菌室或超凈工作臺、生物安全柜。

注：移液管、采樣瓶、培養皿、三角瓶等玻璃器皿試驗前要按無(wú)菌操作要求包扎，高壓蒸汽滅菌器（7.3）121℃滅菌 20 min，烘干，備用。

8 樣品

8.1 樣品采集

      點(diǎn)位布設及采樣頻次按照 HJ/T 494 和HJ/T 91 的相關(guān)規定執行。

      采集微生物樣品時(shí)，采樣瓶（7.1）不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。

      如果采集的是含有活性氯的樣品，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液（6.13），以除去活性氯對細菌的抑制作用（每 125 ml 容積加入 0.1 ml 的硫代硫酸鈉溶液）；如果采集的是重金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.14），以消除干擾（每 125 ml 容積加入 0.3 ml 的乙二胺四乙酸二鈉溶液）。

      注：15.7 mg 硫代硫酸鈉（6.11）可去除樣品中 1.5 mg 活性氯，硫代硫酸鈉用量可根據樣品實(shí)際活性氯量調整。

8.2 樣品保存

采樣后應在 2 h 內檢測，否則，應 10℃以下冷藏但不得超過(guò) 6 h。實(shí)驗室接樣后，不能立即開(kāi)展檢測的，將樣品于 4℃以下冷藏并在 2 h 內檢測。

9 分析步驟

9.1 方法程序

      樣品中枯草芽孢桿菌黑色變種的鑒定程序見(jiàn)下圖 1。

      注：“＋”表示反應結果陽(yáng)性，“－”表示反應結果陰性。

圖 1 枯草芽孢桿菌黑色變種檢測流程

9.2 樣品過(guò)濾

      用滅菌鑷子（7.10）以無(wú)菌操作夾取無(wú)菌濾膜（6.15）貼放在已滅菌的過(guò)濾裝置（7.8） 上，固定好過(guò)濾裝置。將樣品充分混勻后取 100 ml（高濃度樣品可減少過(guò)濾樣品量或將樣品稀釋?zhuān)┏闉V，以無(wú)菌水（6.17）沖洗器壁 2～3 次。樣品過(guò)濾完成后，再抽氣約 5 s，關(guān)上開(kāi)關(guān)。

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