《水質(zhì) 滅菌指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的鑒定 生物學(xué)檢測法（征求意見(jiàn)稿）》編制說(shuō)明

1 項目背景

1.1 任務(wù)來(lái)源

      2012 年 4 月，原國家環(huán)境保護部辦公廳發(fā)布了《關(guān)于開(kāi)展 2012 年度國家環(huán)境保護標準制修訂項目工作的通知》（環(huán)辦函〔2012〕503 號），由上海市環(huán)境監測中心承擔《水質(zhì)  指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的測定 生物學(xué)檢測法》項目的制訂工作。項目統一編號為 2012-54。

1.2 工作過(guò)程

1.2.1 成立標準編制組

      任務(wù)下達后，上海市環(huán)境監測中心作為承擔單位成立了標準編制組，成員以多年從事微生物監測工作的人員為主。

1.2.2 相關(guān)標準和文獻資料調研

      2012 年，通過(guò)國內外相關(guān)分析方法比較研究，分析總結枯草芽孢桿菌黑色變種測定的技術(shù)特點(diǎn)和問(wèn)題、技術(shù)發(fā)展趨勢、新技術(shù)的可行性；結合相關(guān)法律、法規和政策的研究和分析，提出標準制修訂的必要性，完成標準開(kāi)題論證報告和標準草案的編寫(xiě)。

1.2.3 召開(kāi)研討會(huì )，研究建立標準方法，開(kāi)展方法研究

      按照標準制定要求，參考相關(guān)標準和資料，召開(kāi)研討會(huì )，就標準編制的重難點(diǎn)進(jìn)行討論， 最終確立實(shí)驗方案。于 2012 年～2014 年開(kāi)展了標準方法研究試驗和適用性試驗。

1.2.4 開(kāi)題論證，確定標準制定的技術(shù)路線(xiàn)和原則

      2014 年 4 月 7 日，標準開(kāi)題論證報告和標準草案通過(guò)了環(huán)保部科技標準司組織的開(kāi)題論證會(huì )，并提出了修改建議：將標準適用范圍確定為“含活性微生物廢水經(jīng)滅菌處置后，枯草芽孢桿菌黑色變種的測定”；調整檢測方法程序，先篩查后鑒定；根據相關(guān)排放標準要求， 確定合理的樣品取樣量。

1.2.5 落實(shí)專(zhuān)家意見(jiàn)，深入開(kāi)展方法試驗研究

      2014 年 5 月～2015 年 6 月，根據開(kāi)題論證意見(jiàn)，標準編制組按照《國家環(huán)境保護標準制修訂工作管理辦法》（國家環(huán)境保護總局 2006 年第 41 號）、《環(huán)境監測 分析方法標準制修訂技術(shù)導則》（HJ 168-2010）等文件的要求開(kāi)展和增加相關(guān)試驗；并準備實(shí)驗室方法驗證工作，著(zhù)手編寫(xiě)《水質(zhì) 指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的測定 生物學(xué)檢測法》標準征求意見(jiàn)稿及方法驗證方案。

1.2.6 方法驗證工作

      2016 年 03 月～2016 年 6 月，組織 6 家有資質(zhì)的實(shí)驗室進(jìn)行方法驗證，于 2016 年 6 月收回所有的驗證報告，隨后進(jìn)行了數據的匯總和整理分析工作，編制《水質(zhì) 指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的測定 生物學(xué)檢測法》驗證報告。

1.2.7 標準征求意見(jiàn)稿和編制說(shuō)明

      2016 年 6 月～2016 年 12 月，完善《水質(zhì) 指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的測定 生物學(xué)檢測法》征求意見(jiàn)稿并編寫(xiě)標準編制說(shuō)明。

1.2.8 標準研討會(huì )

      2017 年 1 月 13 日，于北京召開(kāi)了《水質(zhì) 指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的測定 生物學(xué)檢測法》標準編制工作的研討會(huì )，經(jīng)質(zhì)詢(xún)和討論，形成意見(jiàn)：將適用范圍修改為“本標準適用于含活性微生物廢水經(jīng)滅菌處置后的滅菌指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的生物學(xué)檢測”；標準文本中 3 方法原理內容建議進(jìn)一步詳述；標準文本中 4 試劑和材料內容進(jìn)行部分修改；標準文本的部分注解、引用等文字進(jìn)行適當更正。

1.2.9 標準征求意見(jiàn)稿編制

      2017 年 1 月～2018 年 6 月，修改完善《水質(zhì) 指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的測定 生物學(xué)檢測法》標準征求意見(jiàn)稿及編制說(shuō)明，并進(jìn)行了專(zhuān)家函審。

1.2.10 召開(kāi)標準征求意見(jiàn)稿技術(shù)審查會(huì )并根據審查意見(jiàn)修改

      根據生態(tài)環(huán)境保護部環(huán)境監測司要求，于 2018 年 7 月 6 日召開(kāi)了《水質(zhì) 指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的測定 生物學(xué)檢測法》標準征求意見(jiàn)稿技術(shù)審查會(huì )，審查專(zhuān)家提出了將標準名稱(chēng)改為《水質(zhì) 滅菌指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的鑒定  生物學(xué)檢測法》，明確方法適用范圍，完善方法原理、干擾和消除的表述，在樣品采集中增加干擾和消除的步驟，補充芽孢染色鏡檢的描述和圖例，質(zhì)量保證和質(zhì)量控制中細化試劑和培養基質(zhì)量控制要求等審查意見(jiàn)，編制組根據專(zhuān)家審查意見(jiàn)，修改標準名稱(chēng)，對文本相應內容進(jìn)行修改和補充。

2 標準制修訂的必要性分析

2.1 監測意義

2.1.1 枯草芽孢桿菌黑色變種基本情況

      “枯草芽孢桿菌黑色變種 Bacillus subtilis var. niger”，由美國的 Elizabeth 最先分離得到，因其在含酪氨酸的培養基上產(chǎn)棕黑色素而得名。1989 年，Nakamura 依據 DNA 相似性研究，提議將包括“枯草芽孢桿菌黑色變種”在內的菌株劃分為新的一個(gè)種，2001年該種被學(xué)術(shù)界承認和接受，命名為“萎縮芽孢桿菌”。

      Nakamura 將萎縮芽孢桿菌的形態(tài)特性歸納為：營(yíng)養細胞桿狀，單個(gè)或短鏈狀排列，革蘭染色為陽(yáng)性；細胞寬 0.5μm～1.0 μm，長(cháng) 2.0μm～4.0 μm，可運動(dòng)；芽孢橢圓形、中生、不膨大。生化特性包括：好氧生長(cháng)，V-P 反應陽(yáng)性（V-P 培養基中培養，pH 范圍為 5.3～5.7， DNA 浮力密度為 1.6946 g/cm3～1.6966 g/cm3，G+C 含量為 41 mol%～43 mol%。產(chǎn)過(guò)氧化氫酶，不產(chǎn)氧化酶、硫化氫、吲哚、二羥基丙酮；利用阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、甘露糖醇、水楊苷、蔗糖、海藻糖和木糖發(fā)酵后產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，利用纖維二塘、半乳糖、麥芽糖、甘露糖、核糖、甲基戊糖和ft梨糖醇產(chǎn)酸的過(guò)程不穩定?？蓪⑾跛猁}還原成亞硝酸鹽，水解淀粉和酪蛋白，利用檸檬酸鹽，消化吸收酪蛋白；不能利用丙酸鹽，不能發(fā)酵乳糖和蜜二糖，不能分解蛋黃卵磷脂、吐溫-80、尿素、精氨酸、賴(lài)氨酸、鳥(niǎo)氨酸、苯基丙氨酸和酪氨酸；在石蕊牛乳中 pH 呈堿性。最適宜生長(cháng)溫度為 28～30℃，最高生長(cháng)溫度為 50℃～55℃，最低生長(cháng)溫度為 5～10℃，在 pH 為 5.6 或 5.7，含 7%NaC1 條件下生長(cháng)，在含有 0.001%的溶解酵素情況下，生長(cháng)被抑制。

      而本標準為了便于國內應用與識別，仍稱(chēng)“枯草芽孢桿菌黑色變種”， 其分類(lèi)地位見(jiàn)下圖 1，代表菌株編號 ATCC 9372。

      >細菌

           >厚壁菌門(mén)

                 >桿菌

                       >芽孢桿菌目

                             >芽胞桿菌科

                                    >芽孢桿菌屬

                                           >枯草芽孢桿菌群

                                                  >枯草芽孢桿菌黑色變種

?圖1 枯草芽孢桿菌黑色變種分類(lèi)地位

2.1.2 檢測意義

      枯草芽孢桿菌黑色變種作為枯草芽孢桿菌亞種，本身不具有危害性，因能產(chǎn)生對熱、紫外線(xiàn)、電離輻射和某些化學(xué)物質(zhì)很強抗性的芽孢，可以作為消毒劑檢測及滅菌質(zhì)量控制方面的質(zhì)量控制標準菌株進(jìn)行應用。

      《美國藥典》將枯草芽孢桿菌黑色變種作為干熱消毒、環(huán)氧乙烷控制的生物指示劑及用于醫藥物品消毒與無(wú)菌保證；《歐洲藥典》將其作為殺菌法的生物指示劑；我國在《中國藥典》、《消毒與滅菌效果的評價(jià)方法與標準》(GB 15981-1995)、《消毒技術(shù)規范》均將枯草芽孢桿菌黑色變種作為消毒滅菌指示微生物；英國、瑞士等國標準協(xié)會(huì )在健康產(chǎn)品相關(guān)的標準或與醫療器械相關(guān)的標準中已將該菌株作為環(huán)氧乙烷滅菌、干熱滅菌和其它液體化學(xué)消毒劑的指示劑。

      此外，枯草芽孢桿菌黑色變種也可作為炭疽桿菌的非致病性替代物，用于軍事等方面研究；用于生產(chǎn)生物表面活性劑，在環(huán)境保護、有機物質(zhì)處理和油回收等領(lǐng)域[8]具有廣闊的應用；用于芽孢形成、萌發(fā)、耐熱機理等研究領(lǐng)域；在分布媒介、凈化模擬及大范圍過(guò)程開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域也有著(zhù)重要的研究意義。美國模式培養物保藏所將枯草芽孢桿菌黑色變種菌株的作用總結為：抗性測試、效力試驗、環(huán)氧乙烷消毒、蒸汽消毒、介質(zhì)測試、無(wú)菌測試及消毒控制。

      綜上所述，枯草芽孢桿菌黑色變種在消毒劑檢測及滅菌質(zhì)量控制方面具有廣泛的應用，而本標準的制定，對水環(huán)境衛生安全的監測和評價(jià)十分關(guān)鍵。

2.2 相關(guān)環(huán)保標準和環(huán)境工作的需要

      醫療廢物監控的需要。為加強醫療廢水排放的管理，有效截斷各種傳染病的傳播途徑， 國務(wù)院頒布了《醫療廢物管理條例》，明確規定醫療衛生機構產(chǎn)生的污水、傳染病病人或者疑似傳染病病人的排泄物，應當按照國家規定嚴格消毒，達到國家規定的排放標準，主要污染物應嚴格執行《污水綜合排放標準》（GB 8978-1996）才可排放?！度珖ｋU廢物和醫療廢物處置設施建設規劃》第二章技術(shù)要求中指出，“小于 10 噸/日的醫療廢物處置設施，必須做到殺菌、滅活、毀形和無(wú)害化，防止二次污染”。

      病原廢水監控的需要。2000 年 6 月由原建設部、國家環(huán)?？偩?、科技部聯(lián)合發(fā)布的“關(guān)于印發(fā)《城市污水處理及污染防止技術(shù)政策》的通知”中規定：“為保證公共衛生安全，防止傳染性疾病傳播，城市污水處理設施應設置消毒設施”。此外，《城鎮污水處理廠(chǎng)污染的排放標準》(GB l8918-2002)中首次將微生物指標列為基本控制指標，規定污水處理廠(chǎng)出水必須進(jìn)行消毒處理，從而使我國污水處理標準的病理指標與國際接軌。目前，國內所有的污水處理廠(chǎng)必須設置消毒設施，常見(jiàn)的廢水消毒處理方法見(jiàn)表 1。

表1 廢水消毒方法比較

      病原微生物消毒監控的需要?！恫≡⑸飳?shí)驗室生物安全管理條例》、《實(shí)驗室生物安全通用要求》（GB 19489）等有關(guān)規定，對涉及生物安全的廢水、廢液、廢氣等進(jìn)行滅活滅菌后才能排放，滅活滅菌方法應符合《消毒技術(shù)規范》的規定?！吨腥A人民共和國傳染病防治法》、《病原微生物實(shí)驗室生物安全管理條例》（國務(wù)院令第 424 號）、《醫院感染管理規范》等法律規范規定：污染物必須進(jìn)行消毒、滅菌效果定期檢測。常見(jiàn)病原菌滅菌條件見(jiàn)表 2。

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